本應(yīng)用說(shuō)明是在µ-Slide ibiPore SiN載玻片內(nèi)創(chuàng)建單層人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的方案。在涂層和細(xì)胞接種后，使用ibidi pump system泵系統(tǒng)/流體剪切力系統(tǒng)將內(nèi)皮單層暴露于單向?qū)恿骷羟袘?yīng)力下。該方案的重點(diǎn)是將µ-Slide ibiPore SiN與使用ibidi pump system泵系統(tǒng)施加剪切應(yīng)力相結(jié)合。

　　ibidi用于研究動(dòng)態(tài)或靜態(tài)條件下遷移和傳輸?shù)慕鉀Q方案：

　　• µ-Slide ibiPore SiN

　　• ibidi Pump System

　　相關(guān)文件：

　　•Instructions µ-Slide ibiPore SiN

　　•Instructions ibidi Pump System

　　1、材料

　　•µ-Slide ibiPore SiN 0.5μm/20% ibiTreat (貨號(hào)：85216-S,ibidi,德國(guó))

　　•ibidi Pump System泵系統(tǒng) (貨號(hào)：10902.ibidi,德國(guó))

　　•灌流管套裝紅色，15cm,內(nèi)徑1.6mm (貨號(hào)：10962.ibidi,德國(guó))

　　•螺旋式管道夾 (貨號(hào)：10861.ibidi,德國(guó))

　　•人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，HUVEC,(貨號(hào)：C-12203.PromoCell,德國(guó))

　　•內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(貨號(hào)：C-22010.PromoCell,德國(guó)),輔以?xún)?nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基補(bǔ)充混合液(貨號(hào)：C-39215.PromoCell,德國(guó))

　　•Accutase細(xì)胞解離液(貨號(hào)：A1110501.Gibco)

　　•IV型膠原蛋白(貨號(hào)：354233.Corning)

　　•標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備(無(wú)菌工作臺(tái)、細(xì)胞培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、PBS等)

　　重要提示：在實(shí)驗(yàn)前一天，將所有所需材料(如 µ-Slides 載玻片、培養(yǎng)基和灌流管(套裝)在37°C和5%CO2的培養(yǎng)箱中平衡過(guò)夜，這對(duì)防止氣泡隨時(shí)間產(chǎn)生至關(guān)重要。

　　2、包被載玻片

　　•按照生產(chǎn)商的說(shuō)明，將IV型膠原蛋白涂層溶液稀釋至40µg/mL的最終濃度

　　•在 µ-Slide 載玻片上涂上一層涂層 (詳細(xì)的涂層方案見(jiàn) µ-Slide ibiPore SiN 使用說(shuō)明)

　　•吸干涂層溶液

　　•用PBS沖洗兩次

　　•在室溫下晾干 µ-Slide 載玻片，然后再接種細(xì)胞

　　3、制備及接種細(xì)胞

　　•在添加了混合補(bǔ)充劑的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)HUVEC

　　•用 Accutase 細(xì)胞解離液處理細(xì)胞2分鐘，使其分離

　　•收集細(xì)胞懸液

　　•離心細(xì)胞懸浮液，用生長(zhǎng)培養(yǎng)基稀釋以獲得所需的濃度

　　•計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整至2x106 cells/ml的濃度，使細(xì)胞貼壁后的光學(xué)匯合度達(dá)到100%

　　• 將細(xì)胞接種到 μ-Slide ibiPore SiN 的下部通道中(細(xì)胞播種的詳細(xì)說(shuō)明請(qǐng)參閱μ-Slide ibiPore SiN使用說(shuō)明)。

　　•在37°C和5%CO2條件下培養(yǎng)兩小時(shí)，讓細(xì)胞貼壁。

　　重要提示：用于繁殖的培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞不應(yīng)生長(zhǎng)到接近100%的光融合。融合的單層進(jìn)入生長(zhǎng)抑制狀態(tài)，這會(huì)阻止細(xì)胞增殖并改變細(xì)胞的生理機(jī)能。只有在需要單層培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中，才建議采用100%匯合。

　　4、灌注

　　•在相差顯微鏡下控制細(xì)胞貼壁的程度

　　•為清除 ibidi Pump System 泵系統(tǒng)中的氣泡，在連接 μ-Slide ibiPore SiN載玻片前，先讓其運(yùn)行1-2小時(shí)

　　重要提示：實(shí)驗(yàn)當(dāng)天如何清除系統(tǒng)中的氣泡，請(qǐng)參閱ibidi Pump System泵系統(tǒng)使用說(shuō)明

　　•用 ibidi 螺旋式管道夾或霍夫曼管道夾夾住灌流管的管道

　　•將 µ-Slide ibiPore SiN載玻片連接到管道上

　　•緩慢打開(kāi)夾緊的管道，以盡量減小壓力峰值

　　•按照下表中的參數(shù)開(kāi)始灌注實(shí)驗(yàn)。開(kāi)始時(shí)低流量是使細(xì)胞適應(yīng)剪切應(yīng)力的必要條件

　　5、結(jié)果

　　人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)在 ibidi μ-Slide ibiPore SiN 0.5μm 載玻片中以 10dyne/cm2流體剪切力條件下培養(yǎng)(A)和靜態(tài)條件下(B)培養(yǎng)24小時(shí)，窗口大小2mm×2mm，4倍物鏡，相差，比例尺200µm